煙曲霉探針法熒光定量PCR試劑盒使用方法

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

按照試劑盒操作說明或者微生物樣品處理方法做好樣品前處理。

1.2 DNA 提取

根據(jù)您實驗室的具體情況和樣品類型，選擇適當?shù)奶崛〔呗苑椒?。為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，我們建議使用商品化的試劑盒進行提取，嚴格按照對應(yīng)試劑盒說明書進行操作，樣本核酸提取過程中應(yīng)避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測，建議-15℃以下保存。

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2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

2.1 從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃），注意避免強光照射，待溶解后振蕩混勻并低速離心 10 s，使用低吸附吸頭分液取樣，避免試劑損失和浪費。

2.2 根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑

煙曲霉反應(yīng)液

煙曲霉擴增液

用量（樣本數(shù)為N）

19.5μL

0.5μL

2.3 在適當容積的無菌離心管中加入上述試劑，充分振蕩混勻后 2000 rpm 離心 10 s，按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián) PCR 反應(yīng)管中。

2.4 蓋緊八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋, 并注意做好相應(yīng)標識（請標記在八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋兩端突出部位，切勿標記在八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋中間，以免影響信號采集）。將 PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本準備區(qū)，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1.2 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心，核酸加樣過程中應(yīng)避免污染。