結(jié)合物的制備 

    酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。 

    （1）交聯(lián)法：是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。 

    ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與作用，透析除去多余的后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。 

    （2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。 按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法zui為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開(kāi)。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得的分離效果，但費(fèi)用較貴。 

    結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過(guò)濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測(cè)的敏感性。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的靈敏度，達(dá)到zui合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反應(yīng)的zui高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng) 1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中，酶標(biāo)抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。