培養(yǎng)基為大家介紹細胞膜的制備過程

　　1.血液的收集及洗滌

　　將血液收集在含有抗凝劑的容器中，每30mL 血液加約5mL 肝素－pH7.4等滲磷酸鹽緩沖溶液。

　　為避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使培養(yǎng)基膜蛋白發(fā)生變化，以下操作應在－4℃低溫下進行。取30mL血液，于冷凍離心機(4℃)中3000r/min 離心20min，使紅細胞沉淀，用吸管吸盡血漿及沉淀的紅細胞表層的絨毛狀沉淀層，以避免其他類型細胞的混入。

　　將紅細胞置于3倍量預冷的pH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中，用玻璃棒緩慢地攪拌懸浮，4℃5000r/min離心15min，除去上清液及沉淀表層，重復洗滌3次。

　　2.溶血和紅細胞膜的洗滌

　　在洗凈的紅細胞中，按照1:40的比例加入預冷的10mmol/LpH7.4低滲Tris(三羥甲基氨基甲烷)－HCl 緩沖液，邊加邊緩慢攪拌，置于4℃冰箱中1～2h，使之完成溶血。然后于4℃9000r/min 離心15min，使紅細胞膜沉淀。重復洗滌、離心3～5次，zui后獲得白色的紅細胞膜樣品。

　　注意：①溶血時低滲緩沖液的用量越大，培養(yǎng)基紅細胞膜中血紅蛋白的殘留量越少，但體積大，離心費時間。因此，紅細胞與緩沖液的容量比例，以1:40為宜。②膜的重量很輕，在溶血后離心傾倒上清液時容易流走，因此要特別小心，盡可能防止膜的損失。③在制備過程中，若pH 值降低，殘留的血紅蛋白會迅速增加。當pH 保持在7.4時，紅細胞膜中的血紅蛋白含量僅占總蛋白量的3~5％，相當于血液中總血紅蛋白的0.1％。但pH 值降低至7.0時，血紅蛋白增加至20％。④上述方法適用于大白鼠和人紅細胞膜的分離。牛、豬等紅細胞膜的制備，若反復進行低滲處理，將造成膜外表面包含具有乙酰膽堿酯酶活性的酯蛋白脫落，使膜容易破碎，得不到較完整的膜樣品。若在低滲緩沖液中加入1mmoL氯化鈣，即可*防止這種膜的不穩(wěn)定性。

　　將zui后一次離心所得到的紅細胞培養(yǎng)基膜懸浮在2～4mLpH7.4等滲磷酸鹽緩沖液中。記錄懸浮液的總體積。注意，有時在膜的下面有少許未解體的紅細胞殘留物，不要將這部分殘留物懸浮在緩沖液中。

　　3.細胞膜的鏡檢

　　取少量膜樣品懸液，在相差顯微鏡下進行觀察，確定膜制品是否純凈。在視野中純凈的膜為扁圓形，白色，膜表面賂有皺紋。在視野中應不含有完整的紅細胞或污染的細菌。

　　4.膜的冷凍干燥

　　培養(yǎng)基樣品放在一個稱好重量的(在分析天平上準確稱量)小稱量瓶中，冷凍干燥至樣品全干(冰凍干燥可以過夜，冷凍干燥的樣品更易溶于SDS 溶液中)，稱量帶有冷凍干燥制品的小稱量瓶，記錄膜的產(chǎn)量。

　　將冷凍干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以備膜結構成分的分析。