巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基和球體細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法

巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基的操作步驟：

    1．實(shí)驗(yàn)前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內(nèi)）。

　　2．引頸殺死動(dòng)物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

　　3．置動(dòng)物于解剖臺(tái)上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

　　4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)。

　　5．用針頭輕輕挑起腹壁，使動(dòng)物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。

　　6．小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養(yǎng)基。

　　7．計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生20～30×105細(xì)胞，其中90％為巨噬細(xì)胞。

　　8．為獲取3×105個(gè)帖附細(xì)胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。

　　9．為純化培養(yǎng)基細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37℃CO2溫箱中培養(yǎng)。

球體細(xì)胞培養(yǎng)基的制備：

    1、瓊脂鋪底的培養(yǎng)基瓶：30ml無菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用。

　　2、取生長狀態(tài)良好已連接成片的細(xì)胞，用彎頭吸管伸入瓶內(nèi)，把細(xì)胞縱橫割劃成若干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液。

　　3、加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當(dāng)細(xì)胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養(yǎng)液3~5 ml，用吸管把已松動(dòng)的細(xì)胞片吸打下來，分裝入1~3個(gè)含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長成細(xì)胞球體。

　　4、換液：培養(yǎng)1~2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)基液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細(xì)胞下沉后，吸除部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)充新培養(yǎng)液。