研生試劑-酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留

鑒于常規(guī)檢測所需儀器設(shè)備昂貴且龐大、笨重，需要熟練專業(yè)技術(shù)人員操作，只能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行抽樣檢測，難以滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的要求，各國科技工作者還應(yīng)用新原理、新技術(shù)試圖研究開發(fā)出一系列特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、準(zhǔn)確安全、簡單廉價(jià)的快速檢測新方法。本研究重點(diǎn)概述國內(nèi)外近期關(guān)于酶抑制法、免疫分析法和生物傳感器在農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)中的研究和應(yīng)用狀況，并展望了酶抑制法、免疫分析法和生物傳感器在農(nóng)藥殘留快速檢測應(yīng)用中的未來發(fā)展趨勢。

酶抑制法是利用有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥可特異性地抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲中毒致死這一毒理學(xué)原理，將AChE與樣品反應(yīng)，如果樣品中沒有農(nóng)藥殘留或者殘留量極少，AChE的活性就不被抑制，反之，如果農(nóng)藥殘留量比較高，AChE的活性就會(huì)被農(nóng)藥所抑制。在酶反應(yīng)試驗(yàn)中加入底物和顯色劑觀察顏色的變化或測定某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號的變化，可判斷是否存在有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。目前，依據(jù)酶抑制法原理設(shè)計(jì)的農(nóng)藥殘留檢測方法主要有速測卡法（紙片法）、比色法（分光光度法）和膽堿酯酶生物傳感器。

1.1速測卡法（紙片法）

將膽堿酯酶(ChE)和乙酰膽堿類似物靛酚乙酸酯分別經(jīng)固化處理后加載到濾紙片上。靛酚乙酸酯在ChE催化下迅速發(fā)生水解反應(yīng)，生成乙酸和靛酚（藍(lán)色）。如果ChE與機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥結(jié)合，便失去催化靛酚乙酸酯水解的能力。因此，在樣品中只要有微量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，就能強(qiáng)烈地抑制藍(lán)色靛酚的生成，靠目測就可判斷農(nóng)藥殘留情況：藍(lán)色（即空白對照卡顏色）或天藍(lán)色（陰性），淺藍(lán)色或白色（陽性）。衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所等7家單位的實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，速測卡法（紙片法）對常用農(nóng)藥的檢出限為0.3~3.5 mg/kg[7]，均高出農(nóng)藥殘留*，因此在使用速測卡檢驗(yàn)蔬菜樣品為陽性時(shí)，即可視為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥已超標(biāo)。該方法檢出時(shí)間為15~30 min，對超出中國允許殘留量或違禁使用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效檢出率可達(dá)80%以上。該方法不需儀器，操作方便、快速，測試成本低，適用于現(xiàn)場篩選。國內(nèi)企業(yè)利用該法原理的商品化速測卡和速測儀適用于基地、農(nóng)貿(mào)市場和超市的一般性農(nóng)藥殘留現(xiàn)場檢測篩查。

1.2比色法（分光光度法）

將蔬菜、水果的農(nóng)藥殘留樣品提取液與從敏感生物 中 提 取 的ChE（GB/T 5009.199—2003推 薦 使 用AChE，NY/T 448—2001推 薦 使 用 丁 酰 膽 堿 酯 酶(BuChE)，GB/T 18630—2002推薦使用小麥酯酶）作用，以硫代乙酰膽堿(GB/T 5009.199—2003)或碘化硫代丁酰膽堿(NY/T 448—2001)或碘化硫代乙酰膽堿(GB/T 18630—2002)為底物，二硫代二硝基苯甲酸(GB/T 5009.199—2003，NY/T 448—2001)或2,6-二氯靛酚(GB/T 18630—2002)為顯色劑，經(jīng)一定時(shí)間反應(yīng)后，利用分光光度計(jì)在412 nm(GB/T 5009.199—2003)或410 nm(NY/T 448—2001)或600 nm(GB/T 18630—2002)波長下比色，根據(jù)吸光值的變化計(jì)算ChE的抑制率(GB/T 5009.199—2003，NY/T 448—2001)或直接利用吸光值(GB/T 18630—2002)，判斷有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)[GB/T 5009.199—2003規(guī)定抑制率≥50%（陽性），NY/T 448—2001抑制率≥70%（陽性），GB/T 18630—2002吸光值＜0.7（未檢出）；0.7~0.9（可能檢出）；>0.9（檢出）]。

比 色 法(分 光 光 度 法)檢 出 限 一 般 在0.05~5.00 mg/kg，檢出時(shí)間為30 min，對超出中國允許殘留量或違禁使用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效檢出率可達(dá)80%以上。國內(nèi)企業(yè)按GB/T5009.199—2003或NY/T 448—2001對分光光度計(jì)進(jìn)行改裝使之適合比色法檢測要求，目前，常用國產(chǎn)農(nóng)藥殘留速測儀均為多通道光路設(shè)計(jì)，可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，直接顯示檢測結(jié)果，還可帶有數(shù)據(jù)接口，通過數(shù)據(jù)管理軟件上傳檢測數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享和網(wǎng)上傳輸，自動(dòng)化程度較高，是目前各省市和縣區(qū)質(zhì)檢監(jiān)督部門日常檢測的主要速測儀器。

AChE和BuChE是酶抑制法的關(guān)鍵和核心，影響ChE的活性和穩(wěn)定性的因素很多，因此，為酶抑制法快速檢測用酶制定標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。目前，只有*頒布了《NY/T 1157—2006農(nóng)藥殘留檢測丁酰膽堿酯酶》[9]，對BuChE的外觀、比活力、定性（包括SDS-PAGE、Km值、布比卡因抑制試驗(yàn)）、穩(wěn)定性、敏感性、裝置等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行了明確規(guī)定。而由于相應(yīng)的缺失，zui常用的AChE活性、定性、穩(wěn)定性和敏感性等指標(biāo)沒有統(tǒng)一的測試和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，造成國
內(nèi)市場上商品AChE質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響速測結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，中國現(xiàn)行的3個(gè)蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量快速檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施均達(dá)10年或10年以上。而近10年來，中國多次修訂了有關(guān)農(nóng)藥殘留*，發(fā)布的《GB 2763—2012食品安全 食品中農(nóng)藥zui大殘留*》[10]已于2013年3月1日起實(shí)施；zui近幾年，速測產(chǎn)品及其配套試劑都得到了快速發(fā)展，并且在實(shí)際應(yīng)用中積累了大量實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，為下一步修訂和更新蔬菜中有機(jī)磷及氨
基甲酸酯農(nóng)藥殘留量快速檢測標(biāo)準(zhǔn)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。