研生試劑-FITC（異硫氰酸熒光素）

異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)
純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為525～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

FITC 是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學反應(yīng)增加硫氰酸基團得到的，硫氰酸基團可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標記

  FITC相關(guān)事項
        分子式：C21H11NO5S
    分子量：389.38
性質(zhì)：
    1. 外觀：黃色粉末
          2. 純度：≥95% （HPLC）

 
3. 產(chǎn)品描述：FITC能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應(yīng)抗原進行定性、定位或定量的檢測。用于醫(yī)學，農(nóng)學和畜牧等方面，可對由細菌病毒和寄生蟲等所致疾病進行快速診斷。 
4. FITC標記抗體流程：                                              

（1）將待交聯(lián)的蛋白（濃度≥1mg/ml）對交聯(lián)反應(yīng)液透析三次4℃，至pH=9.0。交聯(lián)反應(yīng)液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。

（2）將FITC溶于DMSO中，濃度為1mg/mL。每次交聯(lián)使用的FITC均應(yīng)新鮮配制，避光。

（3）按P:F（蛋白質(zhì):FITC）=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，暗處4 ℃反應(yīng)8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L， 4 ℃終止反應(yīng)2 h。     

（5）將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交聯(lián)物的鑒定

　蛋白濃度（mg/mL） = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4

　F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，該值應(yīng)介于2.5 ~ 6.5之間。

（7）FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。 儲存條件：4℃避光保存

FITC是一種常用的綠色熒光探針。FITC的吸收(激發(fā))和發(fā)射峰參見下表。
Fluorophore       Absorption Peak(nm)         Emission Peak(nm) 
FITC                   492                        520  
當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般zui多能結(jié)合15～20個，一個IgG分子可結(jié)合2～8個分子的FITC，其反應(yīng)式如下
FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白質(zhì)  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)
    常用Marsshall(1958)法標記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標記法或Clark等(1963)的透析標記法。
    1．Marsshall法
    (1)材料    抗體球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。
    (2)方法及步驟    ①抗體的準備  取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5～10min。
    ②熒光素的準備  根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
    a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。
    b．總蛋白量(AXB)＝Crag。
    c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
    d．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
    e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
    f． PBS量D-(B+F)=Gml。
    注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。
    ③結(jié)合(或標記)  邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
    ④透析  結(jié)合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜。
    ⑤過柱  取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)；過濾量：12ml標記蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)。
    2．Chadwick法
    (1)試劑和材料    抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等。
    (2)方法及步驟    ①抗體準備  用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。
    ②熒光色素準備  按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。
    ③將準備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結(jié)合(在磁力攪拌機上持續(xù)攪拌)18～24h。
    ④透析和柱層析  方法同Marsshall法。
    3．改良法
    (1)試劑和材料    ①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸餾水
    ②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液配法  取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
    ③3％碳酸鈉水溶液配法  稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
    ④其他試劑和材料  l％*、離心機及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m1)透析袋等。
    (2)方法及步驟    ①取價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0．15mol／LNaCl)及緩沖液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。
    ②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C
下電磁攪拌12～14h。
    ③然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。
    ④將制備好的熒光抗體加*o．01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。
    4．透析標記法

   此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。
   (1)試劑和材料   試劑和材料同改良法。
   (2)方法及步驟   ①用0．025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。
   ②用同一緩沖液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。
   ③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。