研生試劑-子宮內(nèi)膜ER、PR檢測技術(shù)

前幾年國內(nèi)大多采用親和組化法和多克隆抗體的免疫組化方法測定組織中ER和PR，其結(jié)論一直存在爭論。近幾年也開始應(yīng)單克隆抗體測定冰凍切片中的ER、PR，但應(yīng)用常規(guī)的免疫組化法測定石蠟標(biāo)本中ER和PR不能獲得滿意的結(jié)果。本研究設(shè)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)條件下，在石蠟切片中ER、PR的免疫組化染色，旨在探索*的ER、PR免疫組化染色條件。

1　材料和方法

1.1　材料　獲取月經(jīng)周期規(guī)則，血內(nèi)分泌激素測定正常的增生晚期(周期第13天)子宮前、后壁內(nèi)膜各一條，立即放入10%緩沖福爾馬林(pH 7.4)固定液內(nèi)，24 h內(nèi)行石蠟包埋。
1.2　試劑　抗ER、PR單抗，S-P試劑盒和多聚-L-賴氨酸膠(均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供)。
1.3　方法　(1)在清潔玻片涂上一層多聚-L-賴氨酸膠，待其自然干燥；(2)將石蠟標(biāo)本4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟；(3)加3%過氧化酶阻斷劑50 μl，室溫下放置10 min，用蒸餾水沖洗2次，每次3 min；(4)微波下抗原修復(fù)：將片子浸放于0.01 mol.L-1的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中置于微波爐內(nèi)加熱至95℃，10 min，冷卻至室溫，用PBS沖洗2次，每次3 min；(5)加10%正常兔血清50 μl，在室溫下孵育10 min，吸去多余液體；(6)加*抗體(簡稱一抗，為即用性抗ER或PR的單抗)50 μl放置于4℃的冰箱中過夜，用PBS沖洗2次，每次3 min；(7)加生物素標(biāo)記的第二抗體(兔抗鼠單抗)50 μl，置室溫下10 min，用PBS沖洗2次，每次3 min；(8)加SP溶液50 μl，置室溫下10 min，用PBS沖洗2次，每次3 min；(9)加新鮮配制的DAB 100 μl，顯色1～2 min；(10)用自來水沖洗終止顯色，脫水，封片。
為探索ER和PR染色的*條件設(shè)立以下對照：(1)用Elmer?s Glue涂膠對乳腺癌的石蠟標(biāo)本切片8張；(2)常用10%福爾馬林固定24 h以上28張(玻片號ER5、ER6、PR4、PR5)；(3)不用微波處理5張玻片號為ER3、ER4、ER6、PR3、PR5)；(4)加一抗后半小時再加第二抗體5張(玻片號為ER2、ER3、ER6、PR2、PR5)。
1.4　結(jié)果判斷　把封固好的切片置于光鏡下，用低倍和高倍鏡觀察，陽性細(xì)胞為細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒，根據(jù)著色深淺依次為“?”、“?”、“＋”和“-”〔2〕。

2　結(jié)果

2.1　不同涂膠對免疫組化測定的影響　應(yīng)用Elmer?s Glue液涂膠的切片，經(jīng)微波處理，或沒有用微波處理都發(fā)生脫片或部分脫片。而用多聚-L-賴氨酸涂膠的待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后全部完好無損，無脫片現(xiàn)象。
2.2　影響因素　不同固定液、固定時間，微波處理與否以及不同的一抗作用時間對免疫組化測定結(jié)果的影響，見表1和圖1～4。

圖1（玻片號ER1）用緩沖福爾馬林固定液，24h內(nèi)行石蠟包埋，經(jīng)微波抗原修復(fù)，加一抗后4℃冰箱中過夜,ER染色呈強(qiáng)陽性(+++)。S-P×40

圖2（玻片號ER3）不經(jīng)微波處理，其它同圖1，ER染色呈陰性（-）。S-P×40

圖3（玻片號PR1）方法同圖1，PR染色呈強(qiáng)陽性（+++）。S-P×40

圖4（玻片號PR3）不經(jīng)微波處理，其它同圖1，PR染色呈弱陽性（±）。S-P×40

表1　不同條件下ER和PR免疫組化染色的結(jié)果

玻片號 切片數(shù) 固定液和

固定時間

微波處理 作用時間 染色結(jié)果
ER染色
ER1 16 1 1 1 +++
ER2 1 1 1 2 -
ER3 1 1 2 1 -
ER4 1 1 2 2 -
ER5 13 2 1 1 -
ER6 1 2 2 2 -
PR染色
PR1 16 1 1 1 ++
PR2 1 1 1 2 ++
PR3 1 1 2 1 ＋
PR4 13 2 1 1 +++
PR5 1 1 2 2 ＋

注：“1”表示實(shí)驗(yàn)組；“2”表示對照組

3　討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ER和PR定位于陽性組織和細(xì)胞核內(nèi)，胞漿中無ER、PR染色，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔1，2〕。目前國內(nèi)大多采用親和組化法或抗ER、PR多抗測定石蠟標(biāo)本中的ER和PR分布，它通過顯示雌激素(E)或孕激素(P)間接反映ER和PR水平，測定結(jié)果與應(yīng)用單抗免疫組化法不同，在胞漿和胞核內(nèi)均有陽性染色，因此不能排除E或P與細(xì)胞內(nèi)非受體蛋白結(jié)合的可能性，推測這些陽性細(xì)胞可能部分是E或P與細(xì)胞內(nèi)非受體蛋白結(jié)合，并非活性ER、PR，甚至是E或P本身〔3〕，
筆者體會，石蠟切片上成功顯示ER、PR關(guān)鍵是：(1)抗原保護(hù)：10%緩沖福爾馬林(pH 7.4)固定液，24 h之內(nèi)行石蠟包埋，優(yōu)于常規(guī)的福爾馬林固定液。固定時間過久，免疫組化染色結(jié)果差〔3〕；(2)抗原修復(fù)：微波的應(yīng)用解決了過去一直認(rèn)為ER、PR一旦經(jīng)石蠟切片制作過程抗原即遭破壞，而只能在冰凍切片上進(jìn)行的困難；(3)一抗作用時間：在4℃冰箱中過夜，比室溫下作用30 min免疫組化染色效果明顯增強(qiáng)，特別是ER，而PR免疫組化測定要求相對較低，可能是ER較PR不穩(wěn)定，易受破壞，丟失。另外，發(fā)現(xiàn)石蠟切片經(jīng)微波處理，并反復(fù)沖洗，易發(fā)生脫片，多聚-L-賴氨酸涂膠，較常用的Elmer?s Glue涂膠好，很少發(fā)生脫片現(xiàn)象。
作者應(yīng)用該方法研究克羅米酚對子宮內(nèi)膜ER、PR的影響獲得較為滿意的效果〔4〕。該技術(shù)的應(yīng)用將推動生殖內(nèi)分泌的研究，在臨床上為乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的治療和預(yù)后判斷提供客觀的病理依據(jù)。